16S测序与shot弹枪宏基因组测序
要选择微生物组研究
16S测序还是shot弹枪测序？在计划新研究时，几乎所有的微生物组研究人员都会问自己这个问题，因为绝大多数微生物组出版物都使用16S rRNA基因测序或shot弹枪宏基因组测序来生成原始数据，以进行后续微生物分析或宏观素分析。每种方法都有其优点和缺点，您应该选择哪种方法？
什么是16srRNA基因测序？
16S rRNA基因测序，或简单地进行16S测序，利用PCR靶向和扩增细菌16S rRNA基因的高变量区域（V1-V9）部分1。然后将来自单独样品的扩增子给予分子条形码，合并并测序。测序后，使用生物信息学管道分析原始数据，其中包括修剪，误差校正和与16S参考数据库的比较。将读取分配给系统发育等级后，可以生成分类法。同样，其测序遵循相同的策略，但针对真菌基因组中发现的IT（内部转录间隔区）区域。
什么是shot弹枪宏基因组测序？
与仅针对16S rRNA基因的16S测序不同，shot枪元基因组测序序列均给出了来自样品的基因组DNA。库制备工作流程类似于常规的整个基因组测序，包括随机片段化和衔接子连接。shot弹枪宏基因组数据的分类分析的典型工作流程包括质量修剪和与包含整个基因组的参考数据库进行比较（例如，kraken2和离心机3）或选定的标记基因（demaphlan4和motu5）生成分类法。由于shot弹枪元基因组测序涵盖样品中的所有遗传信息，因此可以将数据用于其他分析，例如元基因组装和嵌合，代谢功能分析和抗生素耐药性基因分析。
16S/其测序与shot枪宏基因组测序
如果您的研究需要超出分类学分析（例如代谢途径分析）的基因组分析，则由于其更大的基因组覆盖范围和数据输出，应考虑shot弹枪元基因组测序。如果组成分析是研究的主要目的，则两种技术都需要考虑利弊（表1）。
分类学解决方案
16S/其测序的分类分辨率取决于目标区域，生物本身和序列分析算法。近年来，一些错误纠正方法，例如Dada26，极大地提高了该技术的准确性和分类学解决方案。使用DADA2，现在使用常规16S测序的许多生物的物种水平分辨率现在已成为现实。但是从理论上讲，shot弹枪宏基因组测序可以实现应变水平的分辨率，因为它可以涵盖所有遗传变异。尽管实际上，应变水平解决方案的准确性仍然面临技术挑战。即便如此，与16s/其测序相比，shot弹枪宏基因组测序的分辨率更高。
功能分析
如果代谢功能分析是一个目标，那么大多数研究人员将迅速忽略16S及其测序。但是，有一些工具可以从分类学数据中推断代谢功能，例如PICRUST7。但是，由于额外的基因覆盖范围，当需要功能分析时，通常会使用shot枪宏基因组测序。
微生物覆盖范围和推荐样品类型
shot弹枪测序检查所有宏基因组DNA，而16S测序仅16S rRNA基因，这也患有不完全的底漆覆盖率。因此，前者具有更大的跨域覆盖范围。然后，为什么表1表示16S/其测序在细菌和真菌覆盖范围内更好？这源于可用参考数据库的物种覆盖范围，因为这些测序方法的分类学预测在很大程度上取决于所使用的参考数据库。当前，16S/其数据库的覆盖范围比全基因组数据库好得多。这是因为与人类微生物组相关的微生物的整个基因组比与其他环境相关的微生物的基因组更好得多。这就是为什么建议使用shot弹枪宏基因组测序进行与人类微生物组相关的样品（例如粪便和唾液），如果分类法分析是主要目的的原因。
此外，元基因组测序对参考数据库具有更高的依赖性。例如，如果细菌在16S参考数据库中没有密切相关的代表，则您可能能够以更高的系统发育等级或未知细菌识别它。但是，就shot弹枪宏基因组测序而言，如果细菌在参考基因组数据库中没有亲密的亲戚（来自同一属的基因组），则您可能会完全错过它。例如，Zymobiomics Spike-in Control I包含两个与人类微生物组陌生的微生物（Imtechella Halotolerans和Allobacillus Halotolerans），其基因组以前不可用。如果您将其刺入粪便样品并使用shot弹枪测序序列，那么除非您手动将这两个基因组添加到参考数据库中，否则大多数生物信息学管道都会完全错过它们。另一方面，如果通过16S测序进行分析，则将由于参考数据库中的16S序列而被识别。
误报
诸如DADA2之类的错误纠正工具不仅可以改善16S/其测序的分类分辨率，而且还提高了准确性。当从模拟微生物群落中测序DNA时，这将证明这一点（例如Zymobiomics微生物社区标准）。所有16S序列均未恢复，没有序列中没有错误，即没有误报。但是，随着shot弹枪元基因组测序，除非在参考数据库中有一个完美的代表性基因组来测序，否则生物信息学分析可能会预测多个“密切相关”基因组的存在。这些密切相关的基因组可以来自同一属甚至不同属的不同物种。例如，假设有三个密切相关的微生物A，B和C，它们共享一些共同的序列。物种A仅与B和其他序列共享某些序列，仅与C一起。如果参考数据库仅包含来自B和C的基因组，则在测序A时，生物信息学将预测B和C存在B和C。例如，A和B都可能是大肠杆菌和C是沙门氏菌肠;B和C独特共享的序列可能源于水平基因转移，这在密切相关的微生物之间是常见的。因此，在误报方面，16S/其测序更好。
宿主DNA干扰
过多的宿主DNA的存在可能会在16S的库制备过程中引起非特异性扩增，但是通过调整PCR循环和变化的引物可以控制影响。另一方面，对于shot弹枪宏基因组测序而言，宿主DNA的干扰是一个更困难的问题，即使测序的成本显着降低。根据样品类型，一些样品可以包含> 99％的人类宿主DNA，这不仅增加了序列成本，而且还引入了测量的不确定性。这就是为什么许多研究人员研究宿主DNA耗竭的原因，例如Hostzero微生物DNA试剂盒，在图书馆准备shot弹枪测序之前。但是，在宿主DNA耗竭后，可能没有足够的微生物基因组DNA来进行shot弹枪测序，这通常需要1NG的最小输入。宿主DNA的干扰是为什么仅建议对人粪便样品进行浅shot弹枪测序。
DNA输入
虽然shot弹枪宏基因组测序最少需要1 ng DNA输入，但16S/其测序更为敏感，而输入最小值是feytogron，甚至低至16S rRNA基因的10份。
在这里提供帮助
对于所有微生物组研究，16S测序和shot弹枪宏基因组测序之间的选择是关键步骤。除了预算外，还需要考虑该项目的许多方面，包括样本类型，所需分析，分类法和目标生物。考虑到这些考虑因素将帮助您为下一个微生物组项目选择正确的测序方法。这Zymobiomics微生物组排序服务提供16s，IT和shot弹枪测序作为从DNA提取到测序和生物信息学的完整服务。Zymo Research的测序和生物信息学专家很乐意帮助您选择合适的测序方法。
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学到更多参考：
1。Laudadio I，Fulci V，Stronati L，CarissimiC。下一代宏基因组学：方法论挑战和机遇。OMICS综合生物学杂志2019 23（7）：327-333。
2。伍德·德（Wood de），萨尔兹伯格（Salzberg SL）。KRAKEN：使用精确比对的超快元基因组序列分类。基因组生物学2014 15（3）：R46。
3。Kim D，Song L，Breitwieser FP，Salzberg SL。离心机：宏基因组序列的快速和敏感分类。基因组研究2016 26（12）：1721-1729。
4。Segata N，Waldron L，Ballarini A，Narasimhan V，Jousson O，Huttenhower C.使用独特的特异性标记基因的元基因组微生物社区分析。自然方法2012 9（8）：811-814。
5。Sunagawa S等。使用通用系统发育标记基因进行宏基因组物种分析。自然方法2013 10（12）：1196-1199。
6。Callahan BJ，McMurdie PJ，Rosen MJ，Han AW，Johnson Aja，Holmes sp。DADA2：来自Illumina Amplicon数据的高分辨率样品推断。自然方法2016 13（7）：581-583。
7。Langille MGI，Zaneveld J，Caporaso JG，McDonald D，Knights D，Reyes JA，Clemente JC，Clemente JC，Burkepile DE，Vega Thurber RL，Knight R，Beiko RG，Huttenhower RG，Huttenhower C.使用16s RRNA Marker Gene sequerences的微生物社区的预测功能分析。自然生物技术2013 31（9）：814-821。
