DNA甲基化测定的对照德赢vwin体育平台入口

控制如何提高可靠性和再现性

甲基化试验的控制:如何，何时和为什么使用它们

所有的科学实验都需要控制。特定类型的实验需要特定的控制，如DNA甲基化分析。德赢vwin体育平台入口德赢vwin体育平台入口是一种强大的、得到充分研究的表观遗传标记，继续为转录调控、胚胎发育、基因组稳定性和染色质结构提供广泛的见解。DNA甲基化谱的变化也德赢vwin体育平台入口与许多疾病的发展有关¹．许多临床应用已经利用DNA甲基化作为早期检测、诊断和个人治疗的生物标志物德赢vwin体育平台入口^2、3．这需要在特定区域或单碱基水平上对甲基化模式进行准确的表征。

最常用的DNA甲基化分析包括使用NGS德赢vwin体育平台入口技术的亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性PCR (MSP)和甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)分析。为了减少甲基化水平量化的偏差，特别是在临床应用中，每一种测定方法都需要精心设计和优化，以确保其稳健性⁴．整合已建立的控制是优化分析方法和监测分析效果的关键。为了优化DNA甲基化分析，最好使用已知甲德赢vwin体育平台入口基化水平的既定DNA标准。通常，这需要一个甲基化和非甲基化的DNA标准，在所有CpG位点分别包含近100%和0%的甲基化。单独使用这两种标准或结合使用这两种标准可以帮助识别分析开发中的潜在偏差。对于已建立的工作流程，这些标准可作为验证程序和结果的阳性和阴性对照，这在临床试验中加强质量控制和保证是必不可少的。

验证DNA甲基化分析工作流程的质量控制德赢vwin体育平台入口

作为一个良好的实践，甲基化和非甲基化标准应该与实验样品并行处理，作为整个工作流程的质量控制。与期望每次产生一致结果的标准相反，实验样本可能有很多变量，使故障排除变得困难。在基于pcr和基于ngs的DNA甲基化分析中，从样品中德赢vwin体育平台入口携带的抑制剂、引物设计、酶试剂、仪器故障和许多其他因素都可能导致分析失败。标准产生的数据可以建议从哪里开始排除故障。例如，如果标准在与表现较差的实验样本并行运行时表现如预期，则工作流运行正常，说明实验样本质量可能存在问题。如果标准没有按照预期执行，可能是工作流中的问题导致了检测失败。

优化和校准以亚硫酸盐为基础的测定方法的控制

亚硫酸氢盐PCR (BSP)是一种用于单碱基分辨率甲基化分析的常用方法。首先用亚硫酸氢盐特异性引物对样品进行亚硫酸氢盐转化和扩增。对产生的PCR产德赢vwin体育官方网址物进行测序(即Next-Gen Sequencing, Sanger Sequencing, pyrosequencing)并分析，以确定每个胞嘧啶的甲基化状态。然而，为BSP设计的引物对以相同的效率扩增甲基化和非甲基化序列是至关重要的(图1)。否则，任何扩增偏差都可能导致甲基化水平倾斜。

使用甲基化和非甲基化DNA对照， BSP引物可根据以下标准轻松优化(验证):

特异性产物放大
甲基化和非甲基化DNA标准物的扩增同样稳健
当测序时，甲基化和非甲基化的DNA标准物应该分别产生接近100%和0%的甲基化。如果结果偏离预期结果，这可能表明PCR偏倚。

pcr检测 — 图1。亚硫酸氢盐PCR引物对甲基化、非甲基化或部分甲基化模板的扩增效率应相同。等量的亚硫酸氢盐转化的非甲基化和甲基化DNA对照用设计的引物靶向MGMT与实验样品平行扩增。观察到的甲基化和非甲基化模板条带的强度相等，表明引物对是无偏的。

与亚硫酸氢盐PCR不同，甲基化特异性PCR (MSP)需要甲基化和非甲基化模板用两种不同的引物进行差异扩增。一种是甲基化特异性引物集，如果发生扩增，则表明扩增区域完全甲基化。第二引物以非甲基化的模板为目标，因此该引物的任何扩增都表明扩增区域完全非甲基化。如果两个引物都产生扩增子，则该区域部分甲基化。

MSP所需的这两种引物也可以利用优化和验证甲基化和非甲基化DNA对照使用以下指引:

特异性产物放大
甲基化引物只会扩增甲基化对照DNA，而不会扩增非甲基化DNA。
非甲基化引物只会扩增非甲基化的对照DNA，而不会扩增甲基化的DNA。

在引物验证过程中，对甲基化和非甲基化DNA标准物进行表征可以简化过程。例如，如果使用甲基化标准物和非甲基化引物观察到轻微的PCR信号，或者反之亦然，这将表明引物集合是非特异性的。对于已建立的工作流程，特别是在临床分析中，甲基化和非甲基化DNA标准可以作为阳性和阴性对照来验证MSP工作流程。标准将有助于确认整个过程——亚硫酸氢盐转化、扩增和分析——正常运行，并且测试样品的结果是可靠的(图2)。

除了验证引物外，DNA标准物可以用来代替珍贵的样品来优化新引物组的退火温度(图3)。每个新设计的引物组都应该进行退火温度梯度，以确保预期目标的最佳扩增。

有关底漆设计的更多提示，请参阅亚硫酸氢盐初学者指南．

甲基化敏感限制性内切酶(msre)测定的对照

甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)测定依赖于限制性内切酶能够区分甲基化和非甲基化胞嘧啶。如果限制位点没有甲基化，酶将消化DNA，而甲基化位点将不被切割。然后，通过比较消化和未消化样品的扩增，可以使用定量PCR来评估该位点的甲基化。两者之间的∆C(t)越小，甲基化水平越高，反之亦然(图4)。DNA可视化方法，如琼脂糖凝胶，也可用于确定消化是否发生在感兴趣的区域。

甲基化和非甲基化DNA标准物应与实验样品平行消化，以证明限制性内切酶在区分甲基化和非甲基化位点方面的鲁棒性。这也将有助于确定检测对感兴趣区域的敏感性。

放大图 — 图4。放大曲线显示消化和未消化样品之间Ct值的差异。MSRE检测在甲基化和非甲基化DNA标准品中分别检测到100.9%和2.7%的甲基化，证实了该检测是有效的。检测样品甲基化水平为17.3。

其他应用的DNA标准

DNA标准可以用于优化各种其他应用，因为它是具有已知甲基化模式的高质量基因组DNA。这使得它们在滴定实验条件下成为珍贵DNA或有问题的样品类型的理想替代品。例如，在优化FFPE DNA亚硫酸氢盐文库制备时，DNA标准品可以很容易地超声或碎片化，以代表实验样品。

甲基化和非甲基化DNA标准已被改编为许多甲基化试验的对照:

MethyLight化验^5、6
甲基化敏感性高分辨率熔体分析^7号到9号
焦磷酸测序^10、11
甲基化数组¹²
甲基化DNA免疫沉淀¹³
亚硫酸氢盐测序文库制备¹⁴

的人类甲基化和非甲基化DNA标准是人类样本甲基化分析的有效对照集的一个例子。它们已被广泛应用于上述所有化验及其他化验。Zymo Research还提供了一系列其他DNA标准，可用于优化或质量控制的其他化验，以帮助确保您的数据是最高质量的，并准备好发表。

仍然不确定什么标准最适合您的应用程序?请电邮技术支援(tech@zymoresearch.com)寻求帮助!

德赢vwin体育平台入口DNA甲基化标准产品指南

标准	建议应用程序
人类DNA标准
人类甲基化和非甲基化DNA组	亚硫酸氢聚合酶链反应 Methylation-specific PCR MSRE 甲基化敏感性HRM分析
甲基化DNA通用标准	亚硫酸氢聚合酶链反应
人类甲基化和非甲基化(WGA) DNA集	亚硫酸氢聚合酶链反应 Methylation-specific PCR
人类匹配DNA集	亚硫酸氢聚合酶链反应甲基化测定校准
小鼠DNA标准
甲基化DNA通用标准	亚硫酸氢聚合酶链反应
小鼠5-hmC和5-mC DNA组	亚硫酸氢聚合酶链反应甲基化测定校准
大肠杆菌
大肠杆菌非甲基基因组DNA	监测亚硫酸氢盐转换效率(NGS亚硫酸氢盐库现场控制) ELISA标准曲线
人工DNA标准
5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶DNA标准集	高效液相色谱/质量规范 MeDIP
甲基化和非甲基化pUC19 DNA集	监测亚硫酸氢盐转换效率(NGS亚硫酸氢盐库现场控制) MeDIP

引用:
1.罗伯逊博士，DNA甲基化与人类疾病。德赢vwin体育平台入口中国生物医学工程学报，2005,6(8)，597-610。
2.罗伊,d;Tiirikainen, M.， DNA甲基化分类器对癌症早期检测的诊断能德赢vwin体育平台入口力。癌症发展趋势2020,6(2)，78-81。
3.灯芯,w;韦勒,m;范登本特，M.;桑丘,m;维勒,m;冯·戴姆林;布特就c;Hegi m;滑块,m; Reifenberger, G., MGMT testing--the challenges for biomarker-based glioma treatment. Nat Rev Neurol 2014, 10 (7), 372-85.
4.Hernández;谢敏英;庞s.c.;们,h;Forero, d.a，基于pcr的DNA甲基化分析优化方法。德赢vwin体育平台入口生物技术，2013,38(4)，447 - 447。
5.Olkhov-Mitsel大肠;Zdravic d;克隆亚麻,k;范·德·库斯特;Fleshner:;用于检测患者组织和体液中DNA甲基化的新型多重甲基光协议。德赢vwin体育平台入口科学通报2014,4,4432。
6.Delgado-Cruzata l;Vin-Raviv:;Tehranifar p;不过,j .;雷诺兹,d;冈萨雷斯,k;桑特拉;外周血单个核细胞和粒细胞中整体DNA甲基化测量的相关性。德赢vwin体育平台入口中国生物医学工程学报，2014,29(4):359 - 361。
7.里贝罗·费雷拉;达利斯·多斯·桑托斯·库尼亚，W.;恩里克·费雷拉·戈麦斯，L.;阿泽维多·辛特拉，H.;洛佩斯·卡布拉尔Guimarães丰塞卡，L.;费雷拉·巴斯托斯，E.;克林顿·勒莱丽娜;法里亚斯·梅拉·德·瓦斯孔塞洛斯(Farias Meira de Vasconcelos);da Cunha Guida, L.，一种快速、准确的甲基化敏感性高分辨率熔融分析方法用于诊断Prader Willi和Angelman患者。 Mol Genet Genomic Med 2019, 7 (6), e637.
8.Rajić,j .;Inic-Kanada, a;斯坦,大肠;Dinić,美国;Schuerer:;Uskoković,a;Ghasemian大肠;Mihailović,m;Vidaković,m; Grdović, N.; Barisani-Asenbauer, T., Infection Is Associated with E-Cadherin Promoter Methylation, Downregulation of E-Cadherin Expression, and Increased Expression of Fibronectin and α-SMA-Implications for Epithelial-Mesenchymal Transition. Front Cell Infect Microbiol 2017, 7, 253.
9.罗卢斯科(a.a.);布吉尼克，K. E.;Horbacka k;Krokowicz p;结直肠癌中脯氨酰羟化酶PHD1、PHD2、PHD3和天冬酰胺羟化酶FI德赢vwin体育平台入口H的表达和DNA甲基化水平。癌症杂志，2013,13,526。
10.Sparago, a;Verma a;帕特里切利，m.g.;Pignata l;罗威美国;Calzari l;德·弗朗西斯科，n;德尔普雷特，R.;帕伦博,o .; Carella, M.; Mackay, D. J. G.; Rezwan, F. I.; Angelini, C.; Cerrato, F.; Cubellis, M. V.; Riccio, A., The phenotypic variations of multi-locus imprinting disturbances associated with maternal-effect variants of NLRP5 range from overt imprinting disorder to apparently healthy phenotype. Clin Epigenetics 2019, 11 (1), 190.
11.Yu, w;秦,x;金,y;李,y;Santiskulvong c;Vu,诉;曾,g;张,z;周润发,m; Rao, J., Tianshengyuan-1 (TSY-1) regulates cellular Telomerase activity by methylation of TERT promoter. Oncotarget 2017, 8 (5), 7977-7988.
12.范德奥韦拉(Van der Auwera);Yu, w;缩,l;范·内斯特，L.;范·达姆;范马克，e。a。Pauwels p;Vermeulen, p.b.;迪里克斯，纽约州; Van Laere, S. J., Array-based DNA methylation profiling for breast cancer subtype discrimination. PLoS One 2010, 5 (9), e12616.
13.Rauen t;格拉马蒂科斯(A. P.);Hedrich, c.m.;Floege, j .;Tenbrock k;哦!,k;Kyttaris, v.c.;Tsokos, G. C, camp响应性元素调节剂α (CREMα)有助于降低活动性系统性红斑狼疮(SLE)患者T细胞中Notch-1的表达。中国生物医学工程学报，2012,32(4)，433 - 433。
14.吉列兹尼亚科娃;尼尔森，e。k。基谢列夫;Maretina, m.a.;蒂什琴科(Tishchenko, l.l.);弗雷德里克松,r;巴拉诺夫;Schiöth, h.b, SLC23A2和NCOR2基因的甲基化水平与脊髓性肌萎缩的严重程度相关。科学通报，2015,10 (3)，e0121964。

2021年2月5日