在大多数分子生物学实验室中，质粒纯化是一种常见技术。尽管标准的碱性裂解方法已经确定，但令人惊讶的事情仍然可能出错。本指南列出了质粒纯化的一些常见DOS和不含量。

做：检查质粒的副本编号

同一库存应变的质粒产量大肠杆菌可以取决于许多因素。但是，质粒复制的起源将发挥重要作用，因为它将确定质粒的副本数量大肠杆菌细胞。因此，根据质粒的拷贝数，可能有必要扩展质粒准备或执行多个质粒准备，以使下游应用获得足够的质粒DNA。

不要：忘记在您的文化中添加抗生素

一个令人惊讶的常见错误，如果您忘了添加抗生素（或添加太少）在您的文化中，由于选择性压力不足，您可能会遇到质粒的损失。确保在培养物中仔细检查抗生素的浓度。

做：摇动

经常在烧瓶中生长大肠杆菌培养需要适当的充气才能达到最佳生长。通常，这需要以200-250 rpm的速度摇动文化（每分钟旋转）。此外，考虑通过具有最小的培养物与空气体积比为〜1：5的增加培养曝气，并考虑使用困惑的培养瓶。最后，确保培养物使用覆盖物（例如箔片（稍微松动），棉塞或氧气渗透膜）进行足够的曝气。

不要：过度生长你的文化

另一个情况下，如果您允许您的文化生长太长时间，那么您会遇到基因组DNA污染和质量差的质粒准备。接种后12-18小时处理细胞，一旦培养很稠密，但是在过度生长之前，最好处理细胞。

做：测量OD₆₀₀

OD₆₀₀是估计文化密度的好方法，因此您知道何时处理细胞。由于高光密度是无法衡量的，因此请服用培养物的等分试样，使用标准分光光度计稀释十倍并测量。文化准备在OD上进行处理₆₀₀十倍稀释的培养物为0.2-0.35。

不要：超越文化投入限制

许多质粒准备套件都提出了有关培养条件和投入的建议。仔细遵循这些，以确保您不要超负荷裂解和中和和柱。添加过多的文化是降低裂解质量，堵塞色谱柱并降低纯化性能的肯定方法。

做：温柔

正确质粒纯化的关键之一是基因组DNA与质粒DNA的分离。细菌颗粒可以通过移液或涡旋将P1缓冲液重悬于P1缓冲液中。但是，在裂解过程中，您不能过于大致混合，因为您可以剪切基因组DNA，该基因组DNA可以结合到柱矩阵并污染您的准备。

不要：忽略裂解时间

有些人可能会认为，在裂解方面更长的时间更好，假设最好不要抛弃任何DNA。但是，碱性裂解大肠杆菌只能走这么远才能产生透明的裂解物。更多的培养物会导致更多的碎屑，但如果使用太少的裂解缓冲液，则可能不会额外的裂解或质粒释放。另外，不同的菌株大肠杆菌它们对碱性裂解的敏感性有所不同。最重要的是，过长的裂解时间可能导致质粒DNA变性，导致质量差。

做：完全中和裂解物

添加中和解决方案并与裂解液混合后，请立即移至下一步！不完整的中和会导致质量差。确保多次倒入管，以确保裂解液完全中和。即使观察到大蓬松的沉淀物，也要花费更多的时间（请参阅协议），以确保溶液的完整混合。

不要：移液碎片

中和步骤后，许多质粒准备需要离心以将DNA与细胞碎屑分开，从而阐明裂解物。在此步骤中，慢慢工作并避免将不必要的细胞碎片转移到下一步，这可能会干扰结合和/或降低纯度。

做：加酒

许多质粒准备套件都使用乙醇洗涤缓冲液。这些缓冲液通常是作为浓缩物出现的，在使用前必须在乙醇中稀释。这是一个常常被遗忘的常见错误，并导致准备失败。另外，不要忘记确保盖子紧紧拧紧以防止乙醇蒸发。您的下一个质粒准备将感谢您。

不要：microwave the Buffer

在运输过程中，某些缓冲液（P2和结合缓冲液）可能会沉淀。但是，请勿尝试微波炉以将沉淀物回到溶液中。取而代之的是，将缓冲液在30-37°C下孵育长达10分钟，并通过将瓶子倒几次混合。

做：检查纯度

下游转化困境的一个常见原因是盐和蛋白质受到污染。确保测量A₂₆₀/一种₂₈₀和₂₆₀/一种₂₃₀每次净化后的比率，以确保您的准备工作清晰清晰。高于1.8的比率通常被认为是纯净的，没有污染物。

不要：一次处理太多样本

虽然可能很容易堆叠预备以最大程度地提高时间效率，但质粒纯化的一些步骤对时间敏感。不要一次尝试一次处理太多的准备，或者有些准备时间可能会呆太久而被破坏。

做：热洗脱

如果质粒> 10 kb，请考虑使用将其加热至50°C的洗脱缓冲液提高柱基质的洗脱效率。此外，在离心前可以将洗脱缓冲液放在色谱柱上5-10分钟。

不要：忘记内毒素

一些下游应用，例如敏感细胞系的转染，需要无内毒素的质粒制剂。简单而快速内毒素解析技术可以快速消除这些污染物，以确保高质量的转染级质粒。

做：完美的质粒纯化

虽然列表可以继续，但这些是质粒纯化的一些最重要的DO和不含量。尝试关注他们的下一个纯化，并立即确保成功的清洁，纯净质粒准备！

2019年9月9日