用于下一代测序的DNA质量评估

下一代测序技术(NGS)彻底改变了基因组研究，允许在一天内对整个基因组进行测序。这种形式的测序为科学家提供了一种超高通量、可扩展和快速的方法，以回答来自广泛应用和生物系统的遗传问题。如今，NGS是任何生物学家的必备工具。

随着NGS技术的飞速发展，对进入测序管道的高质量和高数量的DNA提出了更高的要求。在这里，我们详细描述了NGS的理想需求。

上天是什么?

次世代测序(大规模并行测序、深度测序或第二代测序)是用来描述几种现代测序技术，允许数百万个DNA片段并行测序。一旦所有这些简短的解读都生成了，生物信息学分析就会把这些片段拼凑在一起。该过程对整个基因组进行多次测序，提供高深度和精确的数据。

如何验证NGS的DNA

进入NGS管道的DNA的质量和数量是最重要的。对低质量的核酸进行测序将导致性能下降，甚至运行失败。正因为如此，有一个优化的DNA提取管道是至关重要的，它可以很容易地扩展。

为了获得最一致和最可靠的测序管道，我们建议通过以下步骤验证NGS的DNA:

概要描述
需要生成核酸图谱来评估样品中存在什么。这可以用琼脂糖凝胶或生物分析仪来完成。样本应具备以下内容:
高分子量基因组DNA
基因组DNA应该是完整的和未剪切的，没有任何大的涂片穿过车道。一些NGS工作流程将在测序过程中进一步分割DNA。如果发生这种情况，可能会导致较低的结果，或者它们可能被完全选择出测序运行。
没有RNA污染
要对基因组DNA进行测序，样品中不应存在任何RNA。虽然RNA可能不会阻碍测序过程，但它可以人为地增加样品中DNA的数量(特别是在分光光度法中)。
纯度
样品的纯度需要通过分光光度法(如NanoDrop™2000)进行评估。通过分析不同波长的吸光度，可以根据吸光度值确定样品中是否存在任何污染物。理想情况下，NGS的DNA样本应该具有以下测量值:
260/280吸收比:~ 1.8
这个比率提供了一个样品中DNA与RNA数量的一般评估。~1.8的比值通常对应高含量的DNA样品，而~2.0的比值对应高含量的RNA样品。低于1.8可能表明蛋白质污染。
吸收比:> 2.0
盐、EDTA、苯酚、碳水化合物和其他污染物的吸收波长都在230纳米左右。较高的260/230比值(高于2.0)表明DNA样本中很少有这些污染物。当260/230比< 1.5时，样品中存在大量的污染物，这会对NGS工作流程中的多种酶促反应产生负面影响。
收益率
荧光定量方法是NGS管道(如Qubit™或Pico/RiboGreen™)的金标准，因为它们只允许DNA定量。然而，只要样品中没有RNA污染，也可以通过分光光度法确定得率。
无论采用何种方法，DNA都应该是高质量、高浓度的。