评估NGS库准备的输入RNA的质量

RNA-sequencing（RNA-Seq）已成为转录组分析的越来越流行的技术^[1]。高质量RNA-seq库的制备对于测序数据的可靠性至关重要，其中输入RNA的完整性和纯度起着至关重要的作用。因此，在进行图书馆准备之前，对输入RNA进行质量控制是一种好习惯。在这里，我们提供了一些最佳建议，以帮助保存和验证输入RNA的质量，以获得更强大的RNA-Seq库。

关于RNA提取

降解的RNA可以偏向基因表达的测量，提供不均匀的基因覆盖范围，并防止分化替代剪接的转录本^[2]。因此，建议尽可能将高融合性RNA用作输入。处理RNA样品时：

收集后立即从样品中提取RNA，尽可能减少细胞RNase活性。如果需要临时样品存储，请在稳定解决方案中保存样品，例如DNA/RNA盾牌或Trizol®，作为这些产物的裂解特性有效地取代了细胞RNass。德赢vwin体育官方网址
在整个工作流程期间，请使用无菌过滤器尖端，以最大程度地减少RNase并进行跨样本污染。
在使用时将纯化的RNA保持在冰上，并将其存储在-80°C中，以减少冻融周期。
用DNase I处理RNA样品，以消除污染的DNA。DNA的存在可能会引入生物信息学处理和结果库的数据分析。

评估可靠NGS库准备的输入RNA的质量

在输入RNA上执行质量控制（QC）：

通过获得片段大小和RNA完整性数（RIN）来表征RNA的完整性。高质量的RNA将具有两个突出的，缓慢的迁移带，代表RRNA片段（例如HeLa细胞的18s和28s）。涂抹和较小片段的突出表明RNA降解。
- 通过首选方法（例如Agilent的挂毯）确定片段大小和RIN（图1中显示的示例数据）。
- 另外，使用传统的凝胶电泳也可以以相似的方式提供尺寸分布信息（图像类似于图1A）。
使用UV-VIS分光光度计（例如Nanodrop™）评估输入RNA的纯度，以确保RNA不受污染的苯酚和混合盐的污染。对于纯RNA，理想的A260/A280比率约为2.0，理想的A260/A230左右为2.0-2.2。
- pH值和波长精度的偏移小至1 nm可能会导致A260/A280比率的变化〜0.2^[3]。因此，如果比较来自多个样品或条件的RNA，我们建议使用相同的缓冲液洗脱RNA并在相同的分光光度计上表征它们。
- 此外，当使用Nanodrop™进行定量时，请注意样品中样品中的污染水平，因为游离核苷酸和污染物可能会偏差数据。^[4,5]
- 因此，我们建议使用更具体的方法来量化RNA，例如Qubit®荧光测定，该方法使用DNA或RNA的染料。