大家大便：如何从粪便中提取DNA
粪便和微生物组
在过去的十年中，人类微生物组研究的数量通过分析粪便样本的多数爆炸。虽然不是最愉快的样本，但我们有很多关于在粪便中可以找到的人类健康和生物学的知识。这些消化废物和微生物的矩阵中包含的是微生物组影响我们健康的许多方法的线索。例如，我们在肠道中携带的微生物群落的营养不良可能会有所不同，从外来病原体的明显感染到导致症状的骨膜的细微变化。
在粪便样品中发现的微生物基因组DNA对于微生物组研究至关重要。尽管科学家一直在不断改进DNA提取技术，但仍存在样本纯化的许多挑战。这些挑战包括偏置微生物裂解，对PCR抑制剂的污染以及粪便基质的变化（硬，软，腹泻等）。粪便DNA提取需要解决这些主要问题，以获得纯净的，无抑制剂的DNA，同时保持高产量。
每个人都大便，结果好坏参半
粪便样品有各种形状，大小和一致性，可能会受到各种因素的影响。供体物种，健康和饮食都有助于粪便材料组成的差异。这会导致质量，一致性和微生物群落组成的差异。
因此，重要的是要拥有非常健壮的纯化工作流程，以确保可以从所有类型的样品中隔离微生物DNA。理想的提取系统有效地裂解了革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株的细菌以及古细菌和真菌，而无需引入任何偏见。相反，使用偏置方法分离细菌DNA可能会对数据分析产生巨大后果，并导致数据解释不正确。通常，这些偏见在不准确的过分代表性中表现出易于散热的生物，以及随后难以散布生物体的不足。
即使有许多纯化工作流遇到的各种各样的问题，以下技巧也可以确保从粪便中成功提取DNA：
分解
- 一点点走很长一段路
- 每个样品具有不同的生物量和细菌丰富度，因此将适当量的样品用于提取方法至关重要。粪便往往非常丰富细菌DNA含量，因此您不需要太多！
- 尝试从只有1毫克健康的凳子开始，然后努力达到更高的量。通常，100 mg产生2.5 ug的DNA
- 对于非常厚的样品或粘性样品，重悬和稀释为保存试剂，例如DNA / RNA屏蔽，将有助于提取步骤，同时保留微生物剖面。
- 或者，用无DNase/RNase无水或PBS（PBS）稀释样品也有助于提取。然而，如果未立即进行提取，则使用水或PBS会导致微生物细胞裂解，并释放DN酶和RNase和RNase和微生物DNA的降解。此外，如果将样品冷冻，水和PBS不会保护样品免受冷冻/解冻偏见。这些样品在裂解之前也可以通过搅拌器进行彻底匀浆。
- 警惕微生物的生长！在收集和运输到实验室进行过滤之间的时间里，微生物种群在收集管中生长时可能会发生变化。您可以做一些事情来确保不会发生增长并偏向您的结果：
- 使用样品存储试剂（例如DNA/RNA屏蔽）
- 收集时溜走
- 收集后立即冷冻样品（尽管请参见上面有关存储和冻结偏见的警告）（图1）
- 对于非常粘性的样品或抑制性物质中较高的样品，请考虑使用比平时更少的样品，以免与PCR中的抑制剂打交道。
- 来自草食动物（例如马和谷物喂养小鼠）的样品在碳水化合物和未消化的植物物质上往往很高。考虑在植物上处理这些样品并进行预处理的CTAB提取，以在纯化前去除这些碳水化合物。
- 需要通过移液将水状的粪便样品转移到裂解管中。最好是用尖端切开的尖端来使孔更宽，以收集液体和颗粒物。
打扫干净
DNA纯度对于成功的下游分析至关重要。如果在隔离期间没有注意以确保样品没有污染物，则需要其他处理步骤。
纯样品的秘诀在于任何纯化方案的结合和洗涤步骤。大多数纯化套件中包含的结合剂，包括快速DNA粪便土壤微生物套件，是一种高度饱和的混沌盐溶液。虽然这对于将DNA与纯化矩阵结合至关重要，但该试剂还将通过与DNA共同残留在230 nm处的高吸光度来偏斜纳米体测量。另外，粪便样品可以包含高水平的多酚化合物，这些化合物共摘取了DNA。应注意确保在使用PCR之前将它们删除，因为它们可以抑制该技术。
为了避免这些问题，我们建议以下内容：
- 在协议的绑定步骤中，不要过度填充列。任何额外的绑定缓冲液都可以将被困在圆柱的边缘或盖中的盐留下。也有更大的机会被多余的样品污染。
- 在洗涤步骤期间，应沿着列的边缘加载洗涤缓冲液，而不是简单地将其喷入柱中。沿着色谱柱的内边缘运行移液器尖端有助于将盐从色谱柱的墙壁上洗净。
- 将洗脱缓冲液直接放在矩阵上。在色谱柱上的其他任何地方移动洗脱缓冲液可能会导致任何残留盐重悬。
- 粪便样品含有胆汁盐和复杂的多糖与DNA 1，2相关的。这些化合物抑制了PCR，因此需要去除下游过程（图2）。如果需要，洗脱的DNA应通过抑制剂去除柱，例如ONESTEP PCR抑制剂去除套件。
参考：
1）Lantz，P.G。等等。（1997）通过在PCR之前使用水性两阶段系统来清除人类粪便样品中的PCR抑制剂。J. Microbiol。冰毒。28，159–67
2）Montiero，L。等。（1997）复杂多糖作为粪便中的PCR抑制剂：幽门螺杆菌模型。J. Clin Microbiol。35，995-8
