微生物组研究中的控制与标准

基于NGS的技术的进步，使得微生物组研究和微生物群落组成、功能和相互作用的解码领域迅速发展。许多研究得出结论，微生物组处理方法的技术变异导致结果的显著变化^{(1 - 3)}．大多数报告的差异是由核酸提取方法、NGS文库制备方法、生物信息数据处理方法和参考数据库选择方法的差异造成的。尽管微生物学工作流程的每一步都有不同的协议和方法带来的复杂性和多样性，但数据正在以前所未有的速度生成。在许多情况下，缺乏对微生物组参考资料的适当控制或比较，意味着无法再现重要和高影响的结论或与类似数据集进行可靠的比较。

常用和公认的对照物或参比试剂通常被称为“标准”，因为它们的包含和考虑允许方法、设备和协议的比较。微生物组标准是微生物群落分析的必要条件。虽然实验样品的微生物组成是可变的，而且往往是未知的，但微生物组标准提供了一种通用的、准确的和一致的测量方法，作为比较的基础。通过提供测量和评估性能的通用控制，微生物组标准表明偏差，允许用户验证和优化方法，实现实验室间比较，并确保可重复性。

如何选择合适的微生物组对照物

微生物组标准的原理很简单:使用具有良好特征的、量化的和已知的微生物输入来执行实验程序并评估输出的一致性。标准可以作为实验样品的并行质量控制来评估方法的一致性。得到的概要文件提供了校准的基础，并在需要时开始排除故障。几种不同类型的NGS微生物组控件是可用的，每一种都检测复杂微生物组处理工作流的不同部分，有时是重叠部分。本文旨在帮助您选择合适的参比试剂和对照物进行微生物组实验。

模拟社区，真正的多样性参考，和插入控制

微生物组参考试剂有几种类别，包括模拟微生物群落，真正的多样性参考物质和峰值控制。每一类都有重叠的特征，例如用作阳性对照，并且每一类在整个微生物组分析工作流程中检测到不同的偏差。微生物组标准的类别和建议的应用列于表1。

模拟群落是精确量化和定义明确的人工微生物群落，作为已知组成和丰度的基本事实。另一方面，从特定的自然来源(如人类粪便)创建真正的多样性参考，稳定并均质，以成为包含真实生活的微生物概况和多样性的共同和一致的对照材料。最后，虽然模拟社区和真实多样性引用意味着要与实验样本并行使用，但峰值控制直接添加到实验样本中，并在每个样本中进行处理。尖刺的独特物种的定义丰度允许绝对细胞数量量化和质量控制为每个个体样本。

元胞模拟社区标准

从整个细胞生成的模拟群落是最常用的微生物组标准，因为它们作为整个工作流程的阳性对照。但也许更重要的是，细胞模拟社区，如微生物群落标准是否用于优化和比较微生物裂解方法^{(4 - 5)}因为它们含有相同丰度的物种，具有广泛的细胞壁抗性和细胞大小。通过将得到的剖面与理论剖面进行比较，可以评估裂解法的能力。例如，如果观察到模拟群落剖面中的革兰氏阴性菌过多，而革兰氏阳性菌相对于理论丰度缺乏，裂解法可能难以打破较厚的细胞壁。

此外，特定地点的微生物标准是另一种有自己用途的模拟群落。例如,肠道微生物组标准包含来自3个王国的21个微生物菌株，以便评估分析肠道微生物组的方法，并作为一般阳性对照^{(6 - 7)}．

最后，日志分布式模拟社区标准，如微生物群落标准II(对数分布)，含有不同丰度的物种，从10种不等²- 10⁸这种物种的对数分布使用户能够评估其微生物组分析工作流程的检测极限^[8]．

DNA模拟社区标准

用纯化的微生物基因组DNA制作的模拟群落标准更多地用于检测偏差和作为优化工具，因为它们被用作文库准备的输入，而不是在工作流程的开始。DNA模拟社区标准，如ZymoBIOMICS微生物群落DNA标准能否用来控制与图书馆准备和生物信息学相关的偏见^[9]．通过首先将标准生成的NGS reads与标准内的基因组对齐，可以将优化重点放在库准备上。在库准备优化之后，可以通过将NGS读取与整个参考数据库进行比对来评估生物信息学管道。

类似于细胞版本，日志分布式DNA标准，如微生物群落DNA标准II(对数分布)，用于评估检测限度，但用于图书馆准备和生物信息学管道。

此外，一项用于宏基因组分析和基因组组装的新兴技术是长读测序，通常被称为第三代测序。高分子量DNA是长读测序文库准备和生物信息学的关键。的ZymoBIOMICS HMW DNA标准是唯一商业化的高分子量模拟群落，并已被用于评估测序化学和生物信息学工具的长读测序吗^{(11 - 12)}．

真正的多样性参考

真正的多样性参考是来自特定自然来源的对照材料，其中包含完整的、不变的微生物群。与具有量化的、已知的和确定的组成的模拟群落相比，真正多样性参考的微生物组成是自然派生的。的ZymoBIOMICS粪便参考与TruMatrix™技术^＊是第一个商业上可获得的真正多样性的长期稳定和批次对批次一致性参考。这一参考的特点是一个真正的粪便样本的微生物多样性以及丰富程度的广泛范围。

可以在每个实验的相同样本上评估运行到运行和用户到用户的一致性。参考材料也可以用来测试系统的适用性，通过挑战实验方法与实际的来源材料。生物信息分析和分类学分配的挑战增加了一个不变的真实多样性样本的复杂性。由于微生物组成是静态的，丰度和组成是稳定的，因此允许用户评估方法和分析的一致性。

在控制

与模拟社区和真正的多样性参考不同，当直接添加到实验样本中时，插入控件提供了不同的功能。ZymoBIOMICS钉入对照由非常独特的物种组成，对人类微生物组和许多其他微生物都是陌生的。这使得它们可以被添加到样品中，而不干扰本地的微生物群。当使用基于ngs的微生物组方法进行分析时，这些物种的确定组成可以定量未知样品中的绝对细胞数。此外，这些插入控件的一种新用法是as原位质量控制，这意味着它可以作为每个样品的阳性对照，而不是整个运行的阳性对照。这对于基于ngs的病原体诊断非常有用。

对于不同的样本类型，可以使用两个插入控件。的ZymoBIOMICS峰值对照I(高微生物负荷)适用于粪便等高生物量样品。的酶生物学峰值对照II(低微生物负荷)用于微生物量低的样品，如痰液和支气管肺泡灌洗液。

选择微生物组标准

在过去的几年里，对微生物组标准、控制和参考资料的需求呈爆炸式增长，这些标准、控制和参考资料提供了不同的和特定的实用工具。Zymo Research的科学家们热衷于为世界创造和提供工具，以提高微生物组数据的准确性和可重复性。因此，ZymoBIOMICS系列标准、参考和对照为各种微生物组的应用提供了一系列的实用程序。关于这些标准和应用程序的其他信息可以在表2中找到。

＊^{TruMatrix™是The biocollcollective的商标。}

2022年4月07日