如何为PCR实验设计底漆

敏感PCR分析的提示和注意事项

底漆设计是良好实时PCR实验设计的关键步骤。在设计底漆时可以考虑许多要素，这些元素可以帮助最大程度地减少对沿线的故障排除。以下是关于为多种PCR分析创建特定有效引物的重要建议。

聚合酶链反应（PCR）是一种生化过程，它使用加热和冷却的重复循环来扩增感兴趣的遗传区域，称为扩增子。在每个循环中，双链DNA首先进行变性，然后冷却，从而使短寡核苷酸引物可以退火到扩增子的每个DNA链的3'端。然后，DNA聚合酶将这些引物用于构建新的互补链，这将导致每个PCR循环的靶向DNA序列的DNA分子数量增加一倍。尽管该系统对于放大和精确量化感兴趣的基因非常有用，但有几种障碍可以降低引物效率并危及您的实验。以下是如何设计用于PCR和实时定量PCR（QPCR），逆转录定量PCR（RT-QPCR），Bisulfite PCR和甲基化特异性PCR（MSP）的最佳建议。

聚合酶链反应（PCR）由许多加热和冷却周期组成，这些循环允许双链DNA变性，寡核苷酸引物的退火以及通过DNA聚合酶对新互补链的延伸。扩增子的拷贝数在每个PCR周期中呈指数增长。 — 图1.聚合酶链反应（PCR）由许多加热和冷却周期组成，这些循环允许双链DNA变性，寡核苷酸引物的退火以及通过DNA聚合酶对新互补链的伸长。扩增子的拷贝数在每个PCR周期中呈指数增长。

如何设计用于PCR和定量实时PCR（QPCR）的引物

底漆设计的提示：

保持熔化温度（t_m）彼此2°C之内的每个底漆对。t_m可以大约通过公式t计算_m=（a+t）x 2+（g+c）x 4，但是，更精确，详细t_m计算工具可在线获得。有类似的t_m底漆之间可确保前进和反向引物同时绑定到其互补的DNA链，从而减少了最高t的底漆的机会_m将与非特异性DNA序列结合。
使用退火温度（t_一个）低于熔化温度的3-5°C。退火温度是底漆与新模板链结合的温度。这需要低于T_m因此，引物可以有效地与靶标结合，但不要太低，以至于引物与非特异性靶标结合。
保持底漆在18-22个碱基对之间。该底漆长度足够长以确保结合特异性，同时也足够短以保持t_m在适当的范围内。
GC含量为35-65％的设计引物。同一核苷酸的长期拉伸（> 4个碱基）之间的35％至65％之间的GC含量将确保足够的序列复杂性，以实现最佳底漆特异性。
最小化G/C重复，尤其是在底漆的3'末端。胞嘧啶和鸟嘌呤的结合亲和力比腺嘌呤和胸腺嘧啶具有更强的结合亲和力，而重复4 g或C的重复序列可以与具有高亲和力的基因组中的许多地方结合。如果这些重复位于底漆的3'末端，则DNA聚合酶可以在脱靶位置扩展，这最终可以降低PCR效率。
将扩增子长度限制为140个碱基对。70-140碱基对之间的扩增子通常足够长，可以设计两个有效的引物和探针（如果需要基于Taqman的测定法）进行QPCR分析。可能需要更长的扩增子，尽管可能有必要调整热循环方案以允许新链的完全伸长。此外，如果样品包含严重碎片的DNA，则最好使扩增子保持较小，以增加具有启动结合的完整目标序列的可能性。

Taqman®探针设计的提示：

保持4至8°C探针的熔化温度高于底漆。对于基于TAQMAN的QPCR分析，探针被设计为在引物开始拉长链之前向靶DNA退火。这将使信号尽可能高，而不会损害特异性。
保持探针长度在20-25个碱基对之间。略长于引物的探针将在整个伸长延伸过程中保持与靶标的结合，并且可能对靶向DNA区域更为特异性。
请勿重叠探针和底漆结合位点。具有重叠结合位点的探针和引物不能在同一反应中使用。
在探针的5'末端避免鸟嘌呤。鸟嘌呤对塔克人探针附着的荧光团具有淬灭作用，这会抑制反应中的信号。

引物和探针的考虑：

请勿设计包含常见SNP的引物或探针。检查基因组数据，以确保底漆和探针结合位点不包含常见的单核苷酸多态性（SNP）。SNP可以通过在测试样品子集中引入序列变化来干扰底漆或探针结合。您可以使用UCSC的基因组浏览器工具检查SNP。
检查寡核苷酸序列中的发夹，自动二聚体和杂音二聚体。避免使用与自身相互作用的寡核苷酸（发夹或自dimers）或反应混合物中的其他寡核苷酸（异质二聚体），尤其是当相互作用发生在引物的3'端时。
检查针对宿主基因组的寡核苷酸序列。引物应特定于目标的目标序列。为了确保对正确基因组位置的特异性，您可以使用NCBI的爆炸工具跨引用引物序列针对整个基因组。

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定量逆转录PCR（RT-QPCR）

上述尖端也适用于称为定量逆转录PCR（RT-QPCR）的略有不同形式的PCR。RT-QPCR允许您从RNA而不是DNA开始执行PCR。首先将RNA转换为cDNA（逆转录或RT），然后用PCR放大，如上一节所述。在成熟过程中，RNA受到剪接，从而从前MRNA序列中去除内含子。因此，mRNA序列与基因组DNA序列不同。借助剪接，可以设计针对RNA转录本特异性的PCR分析。

在外显子连接处的设计底漆以量化mRNA而不是GDNA。如果可能的话，设计至少在外显子连接上的底漆以增加mRNA上GDNA的反应特异性（如果基因组DNA尚未完全从RNA样品中除去）。底漆序列的5'末端中的大多数应位于一个外显子上，在下一个外显子的3'末端只有3到4个碱基。

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图2. RT-QPCR从逆转录步骤开始，该步骤使用逆转录酶将mRNA转换为cDNA。在将mRNA转换为cDNA之后，PCR反应以变性，退火和扩展的循环进行扩增。

Bisulfite PCR

Bisulfite PCR是一个多步骤过程，使用户能够确定PCR扩增子中CPG位点的甲基化状态。Bisulfite PCR的第一步是DNA的硫酸硫酸硫酸氢盐转化。亚硫酸氢盐转化率是一种使用硫酸氢钠将DNA中的所有未甲基化细胞转化为尿嘧啶的过程。相比之下，甲基化的胞嘧啶通过亚硫酸钠处理未改变。在亚硫酸盐转化步骤之后，运行PCR反应，以确定两个引物之间的CpG位点的甲基化状态。在此PCR期间，转化后的尿嘧啶碱被读取并扩增为胸腺素，而甲基化的胞嘧啶继续扩增为胞嘧啶。因此，在原始DNA中被甲基化的细胞固醇将是扩增后DNA序列中唯一剩下的细胞选择。基于此原理，可以通过对硫酸硫酸盐PCR产物进行测序，以鉴定原始DNA样品中细胞学的甲基化状态。虽然该方法可用于学习DNA的甲基化状态，但未甲基化的细胞转化为尿嘧啶会导致两个DNA链失去互补性并强烈降低DNA序列的复杂性。这使得针对感兴趣的DNA区域的引物的设计更具挑战性。

DNA序列中的所有未甲基化胞嘧啶在亚硫酸盐转化率期间都转化为尿嘧啶，然后在硫酸硫酸盐PCR期间放大为胸腺氨酸。相比之下，甲基化的胞嘧啶不受硫酸盐转化过程的影响，并继续在硫酸盐PCR期间扩增为胞嘧啶。 — 图4. DNA序列中的所有未甲基化胞嘧啶在亚硫酸盐转化率期间都转化为尿嘧啶，然后在亚硫酸盐PCR期间放大为胸腺嘧啶。相比之下，甲基化的胞嘧啶不受硫酸盐转化过程的影响，并继续在硫酸盐PCR期间扩增为胞嘧啶。

Bisulfite底漆设计的提示：

设计底漆在26-30个碱基对之间。这将增加设计具有足够T的特定底漆的机会_m。

在70-300碱基对之间保持扩增子。由于亚硫酸氢盐处理往往会破坏DNA，因此长扩增子的扩增比短扩增子更具挑战性。为了获得最佳结果，将扩增子长度保持在70至300 bp之间。

避免使用引物序列中的CpG位点。如果不可避免地将CPG位点包含在底漆序列中，请在底漆的5端定位，并在相对链中的胞嘧啶位置添加退化碱（y）。

让反应进行35至40个周期。亚硫酸氢盐转化是一个苛刻的过程，可导致DNA碎片和损害。设计具有至少35个热循环的PCR程序，以补偿DNA碎片。

使用热启动聚合酶作为亚硫酸盐PCR提高特异性。非特异性扩增在甲硫酸硫酸含量的DNA中相对常见，因为它是富含的。使用热启动聚合酶和优化的引物设计和协议将有助于减少非特异性产品。德赢vwin体育官方网址

保持退火温度在55-60°C之间以提高特异性。

在设计甲硫酸盐PCR的底漆时，最好避免在底漆序列中进行CpG位点，因为这些细胞可能会甲基化，也可能不会被甲基化。If a CpG site cannot be avoided within the primer, locate it at the 5’ end of the primer and include a degenerate base (Y/R) in the place of the cytosine (for forward primers) or complementary to the cytosine (for reverse primers). — 图5.在设计甲硫酸盐PCR的底漆时，最好避免在底漆序列中进行CpG位点，因为这些细胞氨可能会甲基化，也可能不会被甲基化。If a CpG site cannot be avoided within the primer, locate it at the 5’ end of the primer and include a degenerate base (Y/R) in the place of the cytosine (for forward primers) or complementary to the cytosine (for reverse primers).

有关Bisulfite转换的更多信息，请参阅我们的Bisulfite初学者指南。有关DNA和RNA的快速而完整的双氟氟氟氟氟氟氟氟氟芙喜的转化，用于甲基化分析，请参阅我们的范围Bisulfite转换套件，和Zymotaq聚合酶收集。

甲基化特异性PCR（MSP）

甲基化特异性PCR（MSP）依靠扩增来评估亚硫酸盐转化后特定CpG位点的甲基化状态。该系统的成功取决于使用甲基化（M）和非甲基化（U）引物组的模板的差分扩增。虽然对于Bisulfite PCR的MSP底漆设计的大多数考虑因素都是相同的，但引物中的CPG位点的处理方式不同。Bisulfite PCR检查了特定区域中所有CpG位点的甲基化状态，而MSP评估了与引物序列3'端的单个CpG位点的甲基化。