从TRIzol中提取RNA的必备技巧^®

RNA提取是研究基因表达的第一步，使用各种不同的方法，包括北方印迹法、转录组分析和逆转录pcr。这些技术已经在无数的生物医学领域中无处不在，从癌症来心脏病来神经退化，将RNA纯化定位为这些快速发展、高度活跃的研究领域的基础技术。^{1 - 3}

RNA纯化是如何进化的

为了支持这些研究领域惊人的速度和规模，RNA提取协议需要高效和可靠。其中一种方法——酸-胍-苯酚-氯仿萃取法——已经成为高纯度RNA提取的“金标准”。

最初的协议acid-guanidium-phenol-chloroform提取于1987年出版。⁴这种单步骤协议，消除了更耗时的方法和低通量的超离心步骤，是革命性的。⁵总的来说，它将纯化时间缩短到4个小时，提供了“……高产量和纯度的未降解RNA制剂。”^4、5

在提纯开始时，加入酸性溶液来溶解样品，然后离心，将得到的混合物从上到下分离为三种不同的相:水相、间相和有机相。RNA停留在上面的水相中，而DNA和蛋白质和细胞碎片停留在下面的两相中。在过去的几十年里，这一方案基本没有改变，关键的分离试剂是苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液，在市场上以品牌名称出售试剂盒®或Tri-Reagent®。⁶这些试剂既能裂解各种类型的细胞，释放出用于提取的RNA，又能通过抑制(大多数)RNA酶来防止RNA降解。它还允许两个其他协议(因此在品牌名称中使用“三”前缀)并行运行，或随后使用间相和固体有机相基因组DNA和蛋白质的纯化,分别。⁷

Trizol的RNA提取^®

虽然TRIzol®RNA提取看起来相对简单，但许多初次提取者可能会面临一些关键挑战。

留出适当的时间

虽然目前的RNA提取协议不需要4小时(如1987年最初的论文所述)，但从样品裂解到干燥的RNA颗粒再悬浮，你将需要大约一个小时。协议中的所有步骤都是手动完成的，因此总的提取时间很大程度上取决于必须处理的样本数量。

一个主要的瓶颈可能是离心步骤。大多数微型离心机可以容纳20到30个样本，所以如果你处理的样本多于这个数量，你可能不得不分批进行RNA提取，这可以显著增加提取时间。

准备好试剂并了解步骤

TRIzol®RNA提取有四个主要步骤，每个步骤都需要一些试剂:

1. 细胞裂解和相分离:需要TRIzol®(或酸-胍-苯酚基试剂)来溶解你的样品，氯仿用于相分离(如上所述)RNA(水相)和DNA(间/有机相)。
2. RNA降水:水相转移到新的管中，加入异丙醇沉淀RNA。
3. RNA洗:将析出的RNA离心成球，然后用70 - 75%乙醇洗涤。
4. RNA增溶颗粒再悬浮需要水或缓冲溶液，如TE．你可以使用其他的解决方案来重悬RNA，这取决于你的下游应用。如果你打算以后使用，请确保将RNA储存在-70°C。

在这些步骤之间是离心，孵育和风干步骤，所有这些步骤都需要10到15分钟。

提示和技巧

在制备试剂时，一个关键的考虑因素是保持试剂不含rnase。尽管在1987年的论文中发表了什么，一些rna，比如RNase A族由二硫键稳定并保持TRIzol®的活性。⁸如果你和任何RNA提取专家交谈，他们会告诉你，这些会对你的提纯造成严重破坏，给你留下低质量、降解的RNA。

要避免这种情况，请尝试使用稳定的试剂或者准备一个特殊的无rnase区，在那里所有试剂、试管、移液管尖端和移液器都是无rnase的。此外,你的皮肤是RNase污染的来源之一所以尽量减少在提取RNA之前、期间和之后的接触。⁹

注意相位分离

在RNA提取过程中，“决定成败”的主要步骤是相分离(图1)。它需要灵活和小心的移液，以去除尽可能多的水相(RNA)，而不干扰富含dna的间相。

通过干扰间期，纯化的RNA可能被基因组DNA、蛋白质和/或苯酚污染，这会使定量复杂化，降低RNA质量，并抑制下游应用。这使得相分离步骤成为不一致的主要来源，如样品间的杂质和收率的可变性，导致数据分析不准确和重复性低。

此外，如果你确定你有基因组DNA污染，你可能必须在RNA提取之后进行DNase I消化，这可能会增加你的整个工作流程的额外时间。

低输入和小rna

从TRIzol®中提取RNA依赖于用异丙醇沉淀RNA。由于RNA含量较少，沉淀效率较低，可能导致产量极低或根本没有RNA颗粒。一定要按照制造商的说明，添加推荐的输入细胞数量或组织重量。

沉淀法对于提取小rna(如microrna)也是低效的。的量会有偏差的结果小rna恢复。¹⁰通过相分离提取RNA可以选择性富集某些种类的小/miRNAs，从而导致下游分析的偏差。你可以试着用航空公司如糖原，以促进沉淀和提高产量。¹¹另外，市场上也有专门为小RNA设计的RNA纯化试剂盒。

最好的建议:找到一种更简单的方法从TRIzol®提取RNA

虽然TRIzol®萃取仍然被认为是“金标准”，但有很多限制使它不适合你的实验。

Zymo研究的Direct-zolRNA试剂盒为您提供了一个强大的替代方案，将整个RNA纯化协议从一个小时减少到仅仅7分钟。

从在TRIzol®中重悬的样本开始，只有三个简单的步骤:结合、洗涤和洗脱RNA。

首先，向溶解的TRIzol®样品中加入等量的乙醇(1:1)并混合。将RNA与硅基列，洗涤柱，然后洗脱RNA(图2)。

Direct-zol RNA试剂盒包括DNase I，所以你也可以快速去除污染的DNA。它消除了氯仿的需要(没有相分离)，并担心苯酚污染或小RNA回收的偏差(图3)。

在Direct-zol提取过程的最后，结果是高纯度，高产量的RNA -所有的RNA。Direct-zol捕获的/ microrna比传统方法小4倍，甚至可以传递RNA的图像图(图4)。

三步，七分钟，完成了。

更令人兴奋的是……的可能性高通量自动化．Direct-zol有一个基于珠子的解决方案，可以适用于任何自动化平台，包括Tecan、Hamilton和Thermo的KingFisher®。如果您感兴趣，Zymo Research提供免费的自动化脚本和技术支持，以及基于专栏的脚本样品包进行评估．

未来的诊断、药物发现、疫苗开发等都始于高质量的RNA分离，Zymo Research拥有帮助您的实验室实现下一个重大生物医学突破的工具。

2021年10月14日