有时，质粒净化只是不按计划进行。无论矢量是否保持在低拷贝数，培养物密度或文化过度生长的低拷贝数，本指南将有助于您浏览净化困境，并确定提高质粒产量的最佳方式大肠杆菌文化。

增加加工的培养量

有时如何提高质粒产量的最简单方法是输入更多的原料。虽然这在理论上很简单，但在开始向您的质粒准备中添加更多文化之前，有几个考虑因素观察。大多数质粒预备套件对他们可以处理的培养量有局限性，并且这些限制也会根据质粒的拷贝数而变化。

柱基质粒纯化的功效不仅取决于将大质粒加载到塔上，而且也是加载的生物质的总量。如果您想扩大质粒净化，请尝试使用专为培养的高输入而设计的套件，如Zymopure IImimipreps.和maxipreps.，这可以处理更多的文化。

优化你的细菌

有时是特别的大肠杆菌菌株是质粒萃取的次优。如果您在质粒准备的低产率，请重新检查您使用的菌株是否最好用于质粒传播。对于蛋白质表达，一些菌株比有效的DNA复制更优化。其他人具有不需要的副产品，例如碳水化合物或内切德赢vwin体育官方网址核酸酶，其可以用质粒共同纯化。当可能的时候，坚持尝试和测试的菌株大肠杆菌DH5α.含有突变缺乏某些内切核酸酶并提高质粒稳定性。因此，这些修改了大肠杆菌菌株用作用于分子克隆和质粒产生的工作室。

使用最佳增长条件

切勿直接从细菌库存中接种文化。始终从单个殖民地开始作为起动性文化。这确保您的培养源自相同的基因型，并且不是不同菌落的混合，这可能不具有相同的特征。

此外，请务必仔细检查您的增长条件。虽然许多指南将推荐12-16小时的文化，每一个大肠杆菌菌株在其生长速率和最终密度略有不同。有些需要不同的温度，较长的孵育时间，更快的振动速度，或更多氧合。

例如，最大培养体积不应超过生长烧瓶的总体积或者可替代地，围绕释放烧瓶的生长可用于增加曝气，从而增加培养生长。此外，注意到培养的速度，200-250 rpm典型。

另外，总质粒产率可以根据所使用的培养液的类型而变化，通常是Luria-Bertani肉汤（LB）或优于肉汤（TB）。不要害怕尝试你的增长条件，以了解哪些质粒产量。

优化选择性压力和产量

有一种方法可以确保高产质粒制剂大肠杆菌使用抗生素进行选择性压力的培养物。

第一个是抗生素任何分子克隆实验所需的选择。必须确保在您的文化中存在正确的抗生素量，否则缺乏选择压力会导致您的文化在细胞分裂期间开始稀释质粒。

第二种方法使用氯霉素，当培养含有弛豫复制的质粒的菌株时，将蛋白质合成的抗生素从质粒复制中脱离，抗生素。氯霉素治疗可以停止蛋白质生产，但允许大肠杆菌继续“扩增”质粒，导致质粒纯化期间产率升高¹。

质粒扩增的一种方法使用加入培养物中的氯霉素（170μg/ ml）的抑制量，然后进一步孵育直至质粒纯化（通常是第二天）²。报告更高质粒产率的该方法的变化使用加入较少量的氯霉素（10-20μg/ ml），以在质粒净化之前随后在夜间孵育过量的细胞^3.。或者，另一项研究表明，通过在培养中接种的氯霉素（3-5μg/ ml）的亚抑制浓度（3-5μg/ ml）存在下，增加质粒产量增加，直至第二天收获质粒^4.。注意，这些治疗仅适用于不编码氯霉素抗性的氯霉素敏感细胞和质粒。

带来完整的圈子

下次您难以追溯到纯化净化，请应用这些提示如何增加质粒产量并优化您的实验。无论是增加体积，改变生长条件，还会增加更多的选择性压力，还是使用最佳隔离技术，总是有优化的时间来增加你的质粒产量！

参考：
1. Ausubel，FM，等等。分子生物学的当前方案（2003）
2. Sambrook，J，Fritce ef，Maniatis T，分子克隆：实验室手册，第2版。冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989年
3.通过低浓度的氯霉素，Frenkel L，Bremer H，增加质粒PBR322和PBR327的扩增，DNA 5.，Num 6,539-544（1986）
乞丐S，等等。，氯霉素亚抑制水平对PBR322质粒拷贝数的影响大肠杆菌DH5A细胞，实验微生物学和免疫学杂志7,82-88（2005）

2019年9月16日