什么是RRB？

有不断增长的NGS方法可用于配置DNA甲基化。德赢vwin体育平台入口降低的代表硫酸盐测序（RRB）是一种已建立且具有成本效益的方法，非常适合全基因组DNA甲基化分析。德赢vwin体育平台入口RRB利用限制消化物来丰富CPG密集区域。限制酶MSPI是甲基化不敏感的，在CpG环境下在细胞学上切割（图1）。因此，通过用MSPI消化样品，可以确保每个片段至少包含两个CpG位点。由于DNA甲基化德赢vwin体育平台入口主要发生在CPG环境中，因此仅进行CPG富区进行测序，可以使研究人员以降低的成本捕获大量甲基化数据。与其他富集方法不同，RRB可以在单个碱基分辨率上介绍样品，从而使其成为试点甲基化研究的绝佳技术。

RRBS库特征

大多数库准备协议都需要分裂输入，以实现适当的插入尺寸。因此，成功的库将具有与预期插入物相对应的峰值的片段曲线。在RRB中，MSPI同时富集了CpG致密区域和DNA片段，与其他常见文库（如RNA-Seq）相比，库的库较短。由于MSPI识别特定的切割位点（图1），因此所得的库将具有设定的模式，该模式取决于切割位点从单个物种中跨基因组的分布。在人类样品中，如Oda等人所述，MSPI消化将导致峰值约为69、134和205 bp。^[1]MSPI消化后，尖峰对应于片段的长度以及全长Illumina Truseq适配器的长度。

如何对RRBS库进行顺序

图书馆的集中和定量

与所有库制剂一样，使用基于QPCR的方法（例如Illumina）或类似方法进行定量对于确保准确的载荷浓度至关重要。由于RRBS库由一系列片段大小组成，其中一些尺寸可能相对较小，因此在KAPA定量后，必须进行大小调整计算。与浓度相同的较短片段相比，较大的片段将产生更大的荧光信号 - 因此，如果片段比DNA标准的片段更长或更短，则必须执行尺寸调整。此外，在收到phix标准的情况下，谨慎地对其进行KAPA定量，以确认使用适当的峰值量。

Phix Spike-In

RRBS库需要特殊考虑来进行测序：由于CpG富集和Bisulfite转换，RRBS库的含量很高，因此由于MSPI消化而引起的每个库插入时，除了设置模式外，还具有较低的复杂性。常用的PHIX SPIKE-IN控制不仅可以监视关键的NGS指标，还可以引入图书馆多样性，例如RRB中。RRBS库的最佳PHIX SPIKE-IN将根据测序池的内容以及特定的Illumina测序平台而变化。下面建议使用Novaseq的Phix起点。根据第一运行的测序指标，可能需要对PHIX SPIKE-IN百分比进行进一步的优化。

准备最终图书馆

一旦量化了库和尖峰，应根据Illumina提供的系统特定指南稀释和变性。准备尖峰的一种简单方法是首先稀释库池和phix浓度相同，然后结合相应的体积以达到预期的尖峰百分比。例如，要以1.6 pm的加载浓度达到10％的phix尖峰，总体积为1300 µL的组合库和phix对照，将图书馆池和phix分别稀释至1.6 pm，然后结合使用1170 µL的库池，有130 µL的phix。由于与其他图书馆类型相比，RRBS库的大小较小，因此在Illumina标准指南中推荐的值的负载浓度较低，以避免过度聚类。

结论

RRB是一种具有成本效益的全基因组DNA甲基化分析技术。德赢vwin体育平台入口为了获得最佳结果，应特别注意图书馆的量化和尖峰参数。

2022年6月6日