得分更多的孢子DNA

当蓬勃发展的细菌细胞受到恶劣条件和营养限制的威胁时，极端压力会使它们进入生存模式，形成内孢子。这些细菌孢子可能非常艰难，即使在暴露于极端条件之后，由于它们对酶裂解，干燥，辐射，高温和化学处理（例如消毒剂和变性剂）的抗性，因此仍然存在。这些抗性对于宏基因组研究可能非常具有挑战性，因为孢子的有效裂解对于确保样品的微生物谱的准确表示很重要。孢子的效率低下会导致微生物剖面的陈述错误，而从孢子中几乎没有恢复DNA。

为什么这么困难？

孢子的极端性及其对裂解的抵抗是许多因素的产物。内孢子的最外层涂层是蛋白质层，可提供实质性的酶促和耐化学性。在该层的下方是提供进一步的物理和化学障碍的结构：一种称为皮层的肽聚糖细胞壁，其次是生殖细胞壁和内膜。在该内膜内是核心，其中包含DNA和核糖体，并包括其他保护元素，包括二吡啶酸和蛋白质，这些元素进一步保护DNA免受辐射和化学损伤。

分解

孢子很难裂解，并且热处理在从内孢子中解放DNA时往往无效。另外，酶方法取决于生物体的裂解敏感性，即使营养细菌易感，孢子的复杂结构也倾向于使其具有高度耐药性。机械裂解被广泛接受为裂解内生孢子的最有效方法，因为它更健壮且较少。

为了确定不同裂解机制在孢子上的效率，Zymo研究比较了三种裂解方法枯草芽孢杆菌内孢子：化学，机械和热量。结果表明，实现细菌内孢子的完整，无偏裂解的唯一方法是使用具有高速或低速均质剂的高密度珠珠珠。

孢子诱导和间接定量

通过接种诱导细菌孢子的形成枯草芽孢杆菌细胞生长/散发培养基与枯草芽孢杆菌并孵化几天。通过使用Schaeffer和Fulton Spore染色试剂盒（Sigma Aldrich）确定成功的细菌孢子形成，并通过显微镜观察。然后将细菌孢子浓缩并在PBS/甘油溶液中冷冻。由于细菌孢子的尺寸极小，因此无法进行细胞计数，因此通过将细菌孢子悬浮液的系列稀释液进行了间接计数。

调查的方法

评估化学裂解对孢子的疗效

使用几个常见的市售裂解缓冲液（例如Zymo研究基因组裂解缓冲液，Qiagen Buffer AL和Qiagen Buffer AVL）尝试化学裂解，这些裂解没有导致明显的DNA恢复（如预期）（数据未显示）。这并不反映对具有裂解内生孢子的化学物质的全面综述，它只是对一些最常用的细胞裂解缓冲液的评估。

评估热裂解对孢子的疗效

枯草芽孢杆菌在室温（RT），55°C，75°C和95°C下处理孢子1小时。在所有情况下，在纯化中未回收大量DNA，但是在95°C治疗1小时的孢子10⁶与其他孢子处理相比，镀板时细胞生长的减少（图1）。

缓冲区 — 图1：*B.枯草脂*将孢子在95°C下孵育一小时，以确定灭活效率。将孢子镀在BHI培养基上，并在一夜之间孵育。孢子的热处理导致细胞生长降低106。（a）细胞悬浮液的直接板（b）细胞悬浮液的十倍稀释（c）细胞悬浮液的100倍稀释。

评估机械裂解对孢子的疗效

这Zymobiomics DNA微型培养箱在两种不同类型的同质化系统的背景下，评估了含有高密度BashingBeads™（0.1和0.5 mm）的混合物，分类为高速和低速。发现Zymobiomics DNA MiniPrep试剂盒有效地裂解枯草芽孢杆菌20分钟后使用低速均质器（3,200 rpm; Vortex-Genie®2），并在5分钟后使用高速均质器（在6.5 m/s的时间间隔为6.5 m/s，休息5分钟）（FastPREP-24™）（图，图）（图）2）。

在低速装置上增加了珠珠的持续时间超过20分钟，导致产量和最小DNA损失/剪切的变化可忽略不计。然而，在高速装置上，增加珠珠持续时间超过5分钟，导致DNA降解和DNA的损失。值得注意的是，高速装置在ZR BashingBead™裂解管中产生了显着的热量，这可能是导致大量DNA降解的原因。

图2：*B.枯草脂*将孢子在含有0.1＆0.5 mm珠与Zymobiomics DNA MiniPrep试剂盒配对的DNA/RNA屏蔽裂解管（Microbe）中匀浆。当使用Zymobiomics®DNAMiniPrep试剂盒（D4300）使用时，Vortex-Genie®2（低速）和FastPREP-24™（HighSpeed）都能成功恢复DNA。CL =化学裂解。

机械裂解比较

将Zymobiomics DNA MiniPrep与Dneasy®Powersoil®（Qiagen）试剂盒进行了比较，以评估含有6.0 x 10的溶液中DNA的裂解效率和回收率⁸CFU的B.枯草脂内孢子。Zymobiomics DNA MiniPrep始终能够裂解B.枯草脂内孢子并恢复DNA，而Dneasy®Powersoil®套件无法恢复可测量的DNA（图3）。

从孢子中分离的DNA的方案

Zymobiomics DNA MiniPrep的高密度珠制剂（0.1和0.5 mm）被证明有效地裂解B.枯草脂具有高速和低速干扰物的内向孢子表示该套件的多功能性。此外，通过电镀孢子裂解物确定，确定裂解效率大于99％（图4）。裂解后镀以下的活菌落形成单元的数量最小，等同于无法恢复的DNA的皮克图，这表明使用高密度BashingBeads™（0.1和0.5 mm）裂解效率接近100％。

如何从孢子中提取DNA的协议：

将含有内生孢子的内孢子样品/样品添加到ZR BashingBead裂解管中。
将750 UL DNA/RNA屏蔽或Zymobiomics裂解溶液加入样品管，并紧密地盖。
珠子击败样品采用经过验证的方法，用于完全裂解微生物，包括孢子：
1. 低速：Vortex-Genie®
  1. 将管放在水平管适配器上
  2. 以最大速度打开Vortex-genie®
  3. 珠子跳动40分钟（20分钟足以进行孢子裂解，但是40分钟将确保对微生物进行完全裂解以进行宏基因组学研究）
1. 高速：FastPREP-24™
  1. 将管放在珠子中并固定
  2. 珠子以最大速度（6.5 m/s）持续1分钟
  3. 让样品休息5分钟。休息不足可能导致系统错误。
  4. 重复5次，总计5分钟的珠子跳动
以> 10,000 g的旋转样品持续1分钟
使用Zymobiomics DNA试剂盒