RNA隔离的提示和技巧
RNA提取是众所周知的艰难努力。常见的挑战包括RNA降解，低产量和/或纯度以及DNA污染。此外，不同的样本类型具有自己的独特功能，需要特别注意。例如，微生物（例如，革兰氏阳性/阴性细菌，真菌，古细菌等）可以具有坚硬的细胞壁，这些细胞壁对化学和酶促裂解具有难治性。其他样品类型（例如粪便和植物）含有抑制剂（例如多酚，腐殖酸/富芬酸，单宁等），可以与RNA共沉淀并可以抑制下游分析，例如RT-QPCR。
下面，顶级科学家分享了他们的最佳RNA隔离技巧，特别是最大程度地恢复高质量，无DNA RNA的最佳实践。
收集后稳定RNA
RNA可能是不稳定的，并且非常容易降解。许多样品含有高水平的RNass，它们迅速有效地降解RNA。为了最小化这一点，最好在收集时稳定样本。样品稳定的常见方法包括用液氮，干冰乙醇浴或在-80°C冰箱中储存。但是，这些方法具有缺点，例如核酸的冻融损伤，并非所有研究人员在采集样品时都可以立即访问这些方法。德赢体育平台游戏平台
最佳RNA稳定方法：
- 在裂解缓冲液中立即溶解化，该缓冲液会使RNase（例如TRIZOL®，RNA裂解缓冲液等）失活。然后可以立即处理样品或冷冻存储。
- 稳定试剂中的浸没（例如DNA/RNA盾牌）灭活核酸酶并在环境温度长时间保护核酸。这对于正在领域中收集样品或使用宝贵患者样品（例如组织活检，全血等）的研究人员特别有用。
确保完成样品裂解
在RNA提取过程中，最大化RNA产量和质量的最佳方法是确保完全样品裂解。但是，并非所有样品都会容易受到相同的裂解方案的影响。例如，血细胞（例如淋巴细胞，PBMC等）和微生物细胞往往更难有效地裂解。简单地添加基于洗涤剂的裂解缓冲液可能并不总是足够的。为了帮助改善裂解，将裂解缓冲液与机械裂解步骤（例如珠子跳动）配对或在上游（例如蛋白酶K，溶菌酶等）配对很有帮助（图1）。
此外，重要的是要注意，完整的样品裂解还有助于提取过程顺利进行。基于柱的提取方法不完整的裂解可能会导致柱堵塞，缓冲液残留，DNA污染和不完全洗脱。考虑到所有这些，Zymo研究已竭尽全力优化所有常见样本类型的最有效裂解方案。
如何消除DNA污染
与RNA提取有关的另一个常见问题是DNA污染。DNA的存在可以偏向基于紫外线/VIS的定量方法（例如纳米体），人为地增加了RNA定量，高于其实际上。另外，它也可能导致更敏感的下游应用程序（例如RNA-Seq）中的错误读数。为了确保您获得最准确的量化测量结果并避免下游分析中的任何差异，消除任何DNA结转非常重要。这可以通过多种方式（例如Trizol®相分离，DNA去除柱和DNase处理）。
确认DNA存在的最快方法是可视化RNA样品（例如琼脂糖凝胶，AgilentTapestation®等），并寻找28S核糖体RNA带上上方的任何高分子量片段（图2）。其他方法（例如QPCR或QUBIT）也可以使用，如果您执行对DNA污染敏感的下游应用程序，则可以使用。
Zymo Research已使用新型缓冲液和柱系统开发了RNA提取试剂盒，这些系统结合和提取RNA，同时消除污染DNA。相比之下，市场上的许多其他产品都是基于共纯化的，因此德赢vwin体育官方网址保留了高水平的DNA污染。作为附加值，最佳的RNA隔离套件包括用于柱上处理的DNase I。这消除了对萃取后DNase治疗和清理步骤的需求，并简化了从提取到下游应用的过程。下面的图3说明了Zymo圆柱上DNase处理的有效性是基于通过PCR进行DNA扩增的。
为工作选择最佳的RNA隔离套件
Zymo Research知道RNA隔离不是一件型的所有过程，因此开发了一系列最佳的RNA隔离套件，这些套件是为适合大多数样品类型而定制的。另外，大多数这些RNA隔离试剂盒都有各种格式（即MicroPREP，Miniprep，96孔，磁珠等），以适合不同的输入量和吞吐量。
作为参考，表1显示了来自Zymo Research的建议的RNA提取方法/试剂盒的特定样品类型。此外，Zymo研究技术支援团队始终可以帮助确保在任何工作流程中成功提取RNA。
| 样本类型 | 推荐套件 |
|---|---|
| Trizol®中的样品 | Direct-Zol RNA套件 |
| 细胞，组织，BLOD和其他生物流体 | 快的- RNA套件 |
| 病毒RNA | 快的- RNA病毒套件 |
| 全血 | 快的- RNA全血 |
| 尿 | ZR尿RNA分离套件 |
| 组织切片 | 精确幻灯片RNA隔离系统 |
| FFPE样品 | 快的-RNA FFPE小型雷普 |
| 血清，血浆，CSF和羊水的CFRNA | 快的-CFRNA血清和血浆套件 |
| 粪便，土壤，生物膜，水和培养物 | Zymobiomics RNA MiniPrep套件 |
| 植物样品 | 快的-RNA植物 |
| 微生物培养 | 快的- RNA真菌/细菌套件 |
| 昆虫（蚊子，蜜蜂，果蝇，tick虫等） | 快的-RNA组织/昆虫套件 |
| 来自酶促反应，水相等的RNA。 | RNA清洁和集中套件（RCC） |
| 琼脂糖凝胶的RNA | Zymoclean Gel RNA恢复套件 |
| 含有PCR抑制剂的RNA（多酚，腐殖质/富芬酸，单宁等） | ONESTEP PCR抑制剂去除套件 |
| 德赢体育平台游戏平台样品收集和RNA稳定 | DNA/RNA盾牌 |
掌握RNA提取
可以通过牢记三个简单的技巧来从任何样品类型中回收高质量的总RNA：确保样品稳定后收集后，彻底且完全裂解样品，并消除任何潜在的DNA污染。这些技巧将使恢复适合任何下游应用的RNA更容易，并获得每次准确可靠的下游结果。另外，像上面列出的产品一样，全包产品可以德赢vwin体育官方网址简化提取程序，并得到免费的技术支持团队的支持，这些团队可以提供任何其他建议，并帮助任何人成为RNA提取大师！
