针对SARS-COV-2测试的目标选择提示

自中国武汉的Covid-19爆发初始发现以来，诊断测试市场已经大幅增长。由于它们的高灵敏度，使用荧光信号检测SARS-COV-2 RNA靶标的实时逆转录聚合酶链反应（RRT-PCR）试验继续占据全球测试市场。对于目前由FDA授权的Covid-19有超过一百RRT-PCR测试，确定哪些测试具有最佳性能可能具有挑战性。

检测细节

RRT-PCR试验通常检测的SARS-COV-2靶标包括核衣壳（N），包膜（E），穗蛋白，RNA依赖性RNA-聚合酶（RDRP，也称为NSP12），以及开放读数框架1ab（orf1ab）基因¹。N，E和S是结构蛋白，而RDRP和ORF1ab对病毒RNA的复制很重要。N蛋白包将病毒RNA包成螺旋核衣壳，E蛋白质形成围绕病毒RNA的结构，并且S蛋白质由促进宿主细胞侵袭的糖蛋白尖峰组成²。

最佳的CoVID-19 RRT-PCR试验将检测对SARS-COV-2具有高度特异性的靶标，因此不会与其他生物（包括其他病毒和冠状病毒）表现出交叉反应性。这将最大限度地减少假阳性结果的可能性。目标区域还应具有低突变率，以将测定敏感性维持随着病毒的新菌株而随着时间的推移。目标区域还应适用于设计有效的引物和探针。

SARS-COV-2的核衣壳（N）蛋白质与SARS-COV（SARS，2003年席卷亚洲的疾病）具有90％的氨基酸同源性，这表明该基因稳定，序列已被保守时间^3.。在N基因的发散区域设计的引物和探针将确保SARS-COV-2的特异性检测，使N基因成为SARS-COV-2检测最有前景的目标之一。与N基因相反，RDRP基因中的点突变由于这些突变干扰诊断测定和胚胎肽（例如Remdesivir）的诊断测定和抗病毒治疗^4.。同样，在过去两个月内，在英国，南非和日本出现的三种新的SARS-COV-2变体中已经确定了S基因中的多种突变^5.。S基因中的突变更容易发生，因为它们在增加的传播性方面赋予病毒遗传优势^6.。

单一病毒靶对多病毒靶试验

常见的感知是检测多个SARS-COV-2基因靶标的RRT-PCR试验比使用单个SARS-COV-2靶的那些更好。然而，重要的是要理解，测定检测到的目标数量不是测试敏感性或性能的指示。事实上，在自然生物技术上发表的一项研究比美国FDA授权的150次RRT-PCR试验相比，发现使用单一病毒靶设计超过25％的测试^7.。在同一研究中，具有最低的检测限（最高灵敏度）的前六次测试使用了一个SARS-COV-2目标^7.。这表明检测单个SARS-COV-2目标不会降低测试性能，因为市场上的许多最敏感的测试实际上只检测一个病毒目标。

常见误解背后的一个原因是有必要具有RRT-PCR的多个SARS-COV-2靶标的令人担忧的是，病毒在引物和/或探针的结合位点中可以突变。此事件最终将无效单一病毒目标测试，但不是多目标测试。虽然可能，但这是不太可能发生的，特别是如果所选的单一病毒目标被归类为“稳定”。

冠状病毒尤其如此。该病毒家族的长度具有26至32kb的基因组，其大于许多其他RNA病毒（相比，艾滋病毒和流感的基因组分别为9.2和13.6kb）。具有较大基因组的病毒经历了与复制误差和突变相关的较高的健身成本^8.。为了弥补这一点，冠状病毒（与大多数病毒系列不同）使用非结构蛋白14（NSP14）在新的RNA链延长之前去除MIS金属核糖核苷酸^8.。

结果是冠状病毒比其他RNA病毒的复制误差较少，因此随着时间的推移，突变较少和遗传变异较少^8.。例如，据估计，SARS-COV-2以大约一半的流感和四分之一的艾滋病毒的速度突变^9.。因为SARS-COV-2突变得比其他RNA病毒慢得多，因此在制备突变机会的诊断测试并不是至关重要。

此外，为了使单靶RRT-PCR试验无效，突变病毒菌株需要在人口中建立。只有突变赋予病毒的进化优势，才有可能。一个例子是在2020年12月在英国首次检测到的新SARS-COV-2变体，现在正在全世界传播^6.。该SARS-COV-2变体在S基因中具有多种突变（编码尖峰蛋白质），这增加了菌株的传动率，这是一种清晰的进化优势。然而，大多数突变是有害或中立的，这意味着它们在人口中的频率将仍然可以忽略不计，并且它们不会损害单目标RRT-PCR测试的性能，尤其是在基因的某些部分的基因稳定区域上设计的那些。。

挑战

在RRT-PCR期间检测多个靶点也可以增加具有技术困难并获得含糊不清结果的风险。当更多靶标包括在相同的多重RRT-PCR试验中时，反应变得更复杂并且技术问题的机会（例如，在逆转录和/或PCR阶段形成非特异性产品）增加。德赢vwin体育官方网址这可以显着降低测试性能的情况下，其中在没有精心优化的测定设计或以任何方式改变测试方案（例如，通过测试制造商推荐的那些采用不同的样品类型或不同的实验室仪器）。

此外，它可以证明可以更具挑战性，以从使用多个目标而不是单个目标的测试中解释结果。在一个目标放大的情况下，另一个目标没有（当样品中的病毒载荷接近测试的病毒载荷时可能发生），通常需要在准确的结果之前重新测试患者报道^11.。

选择测试

重要的是选择包括遗传稳定的病毒靶（例如N基因的某些区域）并且对于SARS-COV-2具有高度特异性的测试。无论这些标准是否与一个或多个SARS-COV-2靶相遇最终是一个偏好的问题，这与测试的整体性能直接相关。检测限是测试性能的最佳测量，并且在选择Covid-19测试选项时应随着定价和样品吞吐量电位而称重。

Zymo Research的快速SARS-COV-2 Multiplex套件是实现CE-IVD标记的最新Covid-19测试解决方案，并已提交给FDA进行欧盟前审查。在单一反应中分析每个样品以检测RRT-PCR期间的SARS-COV-2和人类内部对照，在不到2小时内产生精确的结果。该测试具有167个病毒拷贝/ mL样品（10病毒拷贝/反应）的最低检测限，使其成为市场上最敏感的测定之一。该套件也与高吞吐量平台兼容，以极具竞争力的价格提供。

参考：
1.李建，赵开，宝杰等。冠状病毒疾病实验室诊断 - 2019（Covid-19）。Clinica Chimica Acta，510：35-46。发布于2020年11月20日：10.1016 / J.CCA.2020.06.045。
2. SARS-COV-2目标区域之间的意义和差异。PerkinElmer应用基因组学。公布2020年4月12日。https://perkineLmer-appliedgenifics.com/2020/04/06/significe-difference-between-target-regions-for-sars-cov-2/
3. Dutta NK，Mazumdar K，Gordy JT。SARS-COV-2的核衣壳蛋白：疫苗发育的靶标。病毒学杂志，94（13）：E00647-20。公布2020年6月16日.DOI：10.1128 / JVI.00647-20。
4. Martinot M，Jary A，Fafi-Kremer S等人。在具有延长的Covid-19的B细胞免疫缺陷患者中，Remdesivir失败依赖于B细胞免疫缺陷患者中的RNA依赖性RNA聚合酶突变。临床传染病，CIAA1474。发布2020年9月28日。DOI：https://doi.org/10.1093/cid/ciaa1474
5. Meredith S.日本已经发现了一个新的Covid变体。以下是它如何比较英国南非的病毒株。CNBC。发布2021年1月11日。https://www.cnbc.com/2021/01/11/japan-.covid-variant-how-it-compares-to-strains-in-uk-south-africa.html.
6.在英国观察到具有多个穗蛋白突变的SARS-COV-2变体的快速增加。欧洲疾病预防和控制中心2020年12月20日出版。https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/sars-cov---variant-multiple-pike-protein-mutations-united-kingdom.pdf.
7. MACKER MJ，Hooker AC，AFShinnekoo E等。Covid-19 Xprize和需要可扩展，快速和广泛的测试。自然生物技术38,1021-1024。发布2020年9月https://doi.org/10.1038/s41587-020-0655-4
8. Rausch JW，Capoferri Aa，Katusiime mg等。低遗传多样性可能是SARS-COV-2的Achilles脚跟。国家科学院的诉讼程序。公布2020年10月6日。https://www.pnas.org/content/117/40/24614.short.
9. Callaway E.冠状病毒是突变的 - 这是否重要？自然新闻。发布2020年9月8日。https://www.nature.com/articles/d41586-020-02544-6
10.临时：新兴SARS-COV-2变体VOC 202012/01的含义。疾病预防与控制中心。公布2020年12月29日。https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/more/scientific-brief-emerging-variant.html.
11. Giri B，Pandey S，Shrestha R等人。Covid-19检测方法分析性能述评。分析和生物分析化学。发布2020年9月18日。https://link.springer.com/article/10.1007/S00216-020-02889-0.

2021年1月15日