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Bisulfite转换概述
从Bisulfite转换开始时，有许多考虑要牢记，以确保最佳性能和随后的准确性德赢vwin体育平台入口分析。用亚硫酸盐的治疗本质上是一个苛刻的过程，它极大地改变了DNA的化学构成和物理特性。输入DNA从一个大型，稳定的双链分子转变为几乎所有细胞菌完全变为乌拉西尔的随机碎片，单链片段的集合。这些变化极大地影响了甲硫酸含量转换的DNA的定量，质量评估，扩增和分析。在下面突出显示了这些点及其在紫外分光光度法（Nanodrop），琼脂糖凝胶电泳和PCR方面所需的特殊考虑因素。
硫酸含量转换DNA的定量
应使用AB260 nm 1.0 = 40 µg/ml的紫外分光光度计（Nanodrop）将转换后的DNA定量为RNA。在确定硫酸含量转换的DNA的恢复时，需要考虑两个主要因素1.）起始材料的完整性，以及2.）RNA污染。在评估恢复时，DNA的质量（在大小）方面是最重要的因素。降解的起始材料将导致在亚硫酸盐转化过程中增加样品损失。另外，RNA污染将对AB260 nm显着贡献，从而高估DNA量。与输入相比，转化为转化率的RNA失去了损失。重要的是，在上述任何一种情况下，转化率均未损害。
评估甲硫酸含量转换DNA的质量
转化的DNA的琼脂糖凝胶电泳（2％凝胶具有100 bp标记）可用于衡量恢复和碎片化。当凝胶首次从凝胶罐中取出时，通常在凝胶中看不到，这是正常的，并且在转换后DNA几乎完全单链。在冰浴中冷却凝胶几分钟将迫使足够的碱基配对，以使溴化乙锭插入以使DNA可见。转换后的DNA将以涂片的形式运行，通常从> 1,500降至100 bp。重要的是要将足够的材料加载到凝胶中以允许可视化：通常约100 ng/井就足够了。
甲硫酸含量转换的DNA的挑战- DNA碎片和有限的碱基配对使得在甲硫酸氢盐转化后很难看到DNA。在2％琼脂糖凝胶中运行Bisulfite转化的人基因组DNA的样品，并在冰浴中（右图）冷却后，用100 bp标记（左图）进行了100 bp标记。
Bisulfite PCR和底漆设计
Bisulfite PCR是最常见的技术，用于甲基化的DNA甲基化分析，也是最容易发生不事的技术。请记住，DNA将显着分散，因为链不再是互补的，几乎完全没有胞嘧啶。底漆设计是成功的Bisulfite PCR的关键。与正常的PCR不同，甲硫酸盐PCR引物需要长（通常在26-30个碱基之间），并且扩增子大小应相对较短（150-300 bp）。理想情况下，底漆不应包含CpG位点，但是，如果需要将它们定位在底漆的5'末端，并在胞质位置具有混合碱基。同样重要的是要注意，只有一个给定的引物集将仅放大甲硫酸含量转换模板的一股。只有反向引物实际上将与靶DNA结合，这又会生成向前底漆向退火的模板。通常，成功放大需要35至40个周期。强烈建议使用热启动聚合酶，因为非特异性扩增在甲硫酸含量的DNA中相对常见，因为它是富含的。在55-60°C之间的退火温度通常很好地工作，并且应在每个新底漆设置的情况下运行退火温度梯度，以确保特定目标的最佳放大。
用于亚硫酸盐PCR的引物的退火梯度。使用55至65oC的退火温度梯度在梯度热循环中孵育重复硫酸硫酸氢盐PCR（从左到右）。在用100 bp DNA标记的2％琼脂糖凝胶中分析每个反应的相等体积。
甲基化特异性PCR（MSP）的底漆设计
甲基化特异性PCR（MSP）依靠扩增来评估特定CpG位点的甲基化状态。该系统的成功取决于使用甲基化（M）和非甲基化（U）引物组的模板的差分扩增。虽然底漆设计的大多数考虑因素与Bisulfite PCR相同，但底漆内的CPG位点的处理却完全不同。对于MSP，必须在非甲基化（U）底漆中的甲基化（M）底漆和胸腺素中的底漆的3'末端定位CpG位点。
亚硫酸盐PCR和甲基化特异性PCR（MSP）的引物设计流程图。（a）硫酸含石处理后，DNA模板的两个转化链不再是互补的。重要的是要注意，只有任何给定的底漆集将仅放大一股。以下示例说明了这一点：（b）硫酸盐PCR的引物设计用于随后的测序和分析扩增子内的细胞穿刺。应避免或在5'-End上避免使用底漆的CpG位点，并在胞嘧啶位置混合底座（y = c/t，r = g/a）。测序数据通常由“ Lollipop”图表示，其中闭合圆圈代表甲基化的胞嘧啶位置和开放圆圈非甲基化的位置。（c）甲基化特异性PCR（MSP）的引物旨在靶向和评估特定CpG位点的甲基化状态。引物内的CpG位点必须位于3'端，以提高其对甲基化（M）或非甲基化（U）模板的特异性。完全甲基化或非甲基化模板将仅在MSP之后从其代表性底漆集中产生单个扩增子。具有混合甲基化的样品将通过两个底漆组扩增。
亚硫酸盐测序
亚硫酸氢盐测序仍然是用于分析甲硫酸硫酸氢盐转换DNA的最常见技术之一，并在整个扩增子中提供了单碱基分辨率。克隆，然后进行测序使用载体特异性引物，以获得定量甲基化的最佳测序结果。不建议对亚硫酸盐PCR产物进行直接测序，因为它通常会产生较差的测序质量德赢vwin体育官方网址，并将部分甲基化位点进行混淆。焦磷酸测序可用作直接测序的替代方案。
下一代Bisulfite测序
越来越多地利用基于下一代测序的应用（RRB）和全基因组亚硫酸盐测序（WGB）来获得全基因组单碱基分辨率分析并识别推定的生物标志物候选者。在这两个工作流程中，转化效率都是最重要的，因为效率的差异相对较小，也会影响数千个单个站点。如果要在亚硫酸盐转化之前进行文库制备，则重要的是，将适配器添加到碎片的DNA中，以保留其序列。如果非CPG甲基化是样品中的一个因素（例如，在植物中），并且考虑到甲基硫酸硫酸甲基转化以区分甲基化（5-MC）和羟基甲基化（5-HMC），则建议使用适当的对照DNA。。
甲基化甲基化图硫酸盐测序（RRB）。甲基化甲基化图硫酸盐测序（RRB）。数据显示了小鼠DNA中单个CpG位点的甲基化相对百分比。甲基化百分比在小鼠染色体的一个〜3 Mb区域中显示出来。使用与该小鼠基因组DNA制备了甲硫酸甲基化的测序文库基因组清洁和集中器（D4010，D4011- Zymo Research）和Bisulfite使用使用EZ 德赢vwin体育平台入口DNA甲基化下一代测序之前的技术。