TRIzol是什么^®?

从TRIzol提取RNA^®一直被认为是RNA纯化的“金标准”。因此，其他商业公司提供类似的试剂与他们自己的命名(TRI试剂^®, RNAzol^®, QIAzol^®， TriPure, TriSure等)。一体化试剂提供了良好的能力，以裂解各种复杂的样品。试剂盒^®易于扩展，可容纳非常大的输入，恢复充足的RNA产量，也是RNA酶的有效灭活剂，防止样品在纯化过程中降解¹．总的来说,试剂盒^®保留了RNA的质量、完整性和数量，使其可以作为存储介质以及提取/纯化溶液。

然而，这种费力的方法存在一些主要障碍，如使用氯仿、离心时间长以及在分离过程中需要沉淀步骤²．该过程可能很繁琐，需要技术技能来确保从样本中充分回收RNA。

试剂盒^®本试剂是一种酸-胍-苯酚基试剂，理想地设计用于从各种生物样品输入中提取RNA(以及DNA和蛋白质)。TRIzol的低pH值(酸性)^®控制将RNA从DNA和蛋白质中分离出来，而高pH值会导致RNA和DNA一起分离。胍盐是使蛋白质变性的朝色剂，苯酚(通常表示为粉红色)是一种有机化合物，也用于提取核酸和蛋白质^3、4．

样品在TRIzol中增溶均质后^®， RNA、DNA和蛋白质通过添加相分离试剂(氯仿、BCP或BAN)进行区别提取。该溶液将RNA与DNA和蛋白质分离为不同的层(图1)。上层透明的水相主要含有RNA，中层间相和下层有机相含有DNA、蛋白质和脂类^3.．随后，上层水相中的RNA通过醇基沉淀法收集。经过长时间的孵育和离心步骤，得到的白色颗粒(如果有的话)然后在乙醇溶液中洗涤，风干，并在最终的样品缓冲液中重新悬浮。

尽管试剂盒^®本身就是一种强大的试剂，加入TRIzol^®对一个样本来说并不是包治百病的。必须考虑样品的类型(生物液体、细胞或固体组织)和TRIzol的体积^®使用。如果上游处理没有考虑周全，样品可能会导致不完全裂解和DNA或苯酚污染。此外，微/小RNA (17-200 nt)和大RNA (> -200 nt)也可能发生偏倚。最后，传统的RNA提取在进行多个样品时可能很繁琐，这使得该方法不适合高通量自动化液体处理平台。

为了有效地溶解样品，TRIzol^®对样品体积比非常重要。通常情况下，增加TRIzol的体积^®比传统方法更能解决RNA提取的大部分问题。或者，在TRIzol中进行机械裂解^®在通过打珠管和高速均质器进行纯化之前，将产生稳健的总RNA(图2)。结合机械均质和增加TRIzol的体积^®将确保最高质量的RNA。

苯酚与基因组DNA污染:在从有机相和间相中去除上层水相时，会发生交叉污染。有机酚、蛋白质、脂类和DNA会在无意中被提升到水相中，导致低质量的RNA(图3)。为了确定苯酚污染，可以在分光光度计上量化RNA样本，用于测量溶液的透过率或反射率。在270 nm处异常的吸光度最大值表示苯酚污染(图4)。对于基因组DNA污染，可以在分光光度计和高分子量带(s)上夸大指标，或者使用电泳在琼脂糖凝胶上涂抹(图5)。

现在有许多非有机和商业试剂盒用于RNA纯化，今天仍有实验室希望继续使用TRIzol^®．有些人可能会在TRIzol中存储样本^®长期还是只偏爱净化试剂。然而，对超纯RNA的处理时间、可靠性和一致性的需求更大。

的Direct-zol RNA试剂盒设计用于净化TRIzol中的任何样品^®没有DNA或苯酚污染和繁琐的相分离或沉淀步骤。只需添加TRIzol^®将与乙醇混合的裂解液放入结合柱，清洗和洗脱(图6)。得到的RNA可用于敏感的下游应用，如RT-qPCR和次世代测序。此外，Zymo-Spin硅基结合柱设计独特，可捕获无偏倚的总RNA，低至picogram量(单细胞)(图7)。